研究内容・業績

蛍光寿命顕微鏡とは

分子が光（ここでは可視光線とする）を吸収すると分子は電子基底状態から電子励起状態に移ります。その後、電子励起状態から電子基底状態に戻る際にエネルギーを放出します。このエネルギーが光の形で放出されるとき、遷移が許容遷移であれば蛍光、禁制遷移であればリン光と呼びます。

 植物葉緑体の光合成色素は光を吸収しますが、光を当てると小さな確率でも蛍光を発することがあります。光のエネルギーが光合成に使われる時は蛍光は出ません。葉緑体の場合、クロロフィルが主な蛍光放出分子です。植物に十分短い時間幅のパルスレーザーを当てたときに放出される蛍光はレーザーが照射された時間に比べてある遅れを伴って試料から放出されます。吸収される光子と蛍光として放出される光子の間の時間の遅れを精密に計測することで電子励起状態の寿命を測定することが可能になります。ある瞬間の蛍光強度は電子励起状態の濃度に比例しているからです。クロロフィルの電子励起状態の寿命は分子間の電荷移動で始まる光合成反応の初期過程を反映しています。組織ごとに異なる葉緑体機能分化の具合、生育環境、生物種等によってクロロフィル蛍光寿命は異なります。また測定の前に植物が感じていた光環境の履歴によっても寿命が異なります。　　　

光物理化学研究室にある蛍光寿命顕微鏡は、顕微鏡ステージ上の試料の焦点から出た蛍光を２つの光子計数検出器で観測します。それらには２つの異なる波長領域の蛍光が入射されます。レーザーの発振時刻を決める光検出器もあり、レーザーの発振時刻を見る検出器の電気パルスと２つの蛍光光子検出器の電気パルスの間の時間差を精密に計測することにより、２つの蛍光波長について同時に蛍光寿命を求めることができます。

卒業生　松山隆一さんの修士論文より引用した装置図　

 画像を構成するために、試料を励起するレーザーの焦点が試料中を高速に２次元走査します。奥行方向の自動操作には対物レンズのピエゾステージが移動します。

一般的なレーザー走査型共焦点蛍光顕微鏡とほぼ同等ですが、励起レーザーには短パルスレーザーを用いること、蛍光検出器が単一光子計数を行うという点が大きな違いです。

 この装置を用いて、植物や藻類の葉緑体や、シアノバクテリアの光合成と光合成機能の環境変化について理解を深めるための研究を行っています。研究成果を投稿するべく準備中で、詳しいことはこの場で解説できませんが、次の様な256×256の画素の全ての画素毎に13ピコ秒の時間刻みで光子の到着時間を記録して、各画素で蛍光寿命を算出することが可能です。 

実際にシロイヌナズナを見たときの蛍光画像　赤が716nm、緑が689nmのデータ

 

葉緑体の一部について選び出して蛍光減衰曲線を得て、それを２つの指数関数の和と装置応答関数の畳み込み積分でフィッティングした結果　縦軸は光子数、横軸は時間(ns)

〈ポスター発表〉 ・Revealing different properties of chloroplasts in different tissues by 3-D fluorescence lifetime imaging microscopy 第56回日本植物生理学会年会　2015/3/18 Tokyo

〈ポスター発表〉 ・Revealing different properties of chloroplasts in different tissues by 3-D fluorescence lifetime imaging microscopy 第23回「光合成セミナー2015：反応中心と色素系の多様性」　2015/7/11 Kyoto
〈ポスター発表〉 ・Chloroplast functions inside plant 3D space visualized by fluorescence lifetime imaging microscopy with systematically changed excitation laser power.  2016 KYOTO-KAIST-NTHU Junior Chemist Symposium 2016/2/17 Kyoto
〈ポスター発表〉 ・Chloroplast functions inside plant 3D space visualized byfluorescence lifetime imaging microscopy with systematically changedexcitation laser power. 第57回日本植物生理学会年会　2016/3/20 Morioka